摘 要：非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起豬的高傳染性疾病，嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。該文從非洲豬瘟病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床癥狀及診斷技術(shù)等方面進(jìn)行綜述，以期為非洲豬瘟病毒準(zhǔn)確、快速診斷和疫病凈化提供參考。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；診斷技術(shù)；研究進(jìn)展

非洲豬瘟（Africa swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（Africa swine fever virus，ASFV）引起的豬的一種急性、熱性和高度傳染性的疾病[1,2]，幾乎可以感染不同日齡的豬[3]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須通報(bào)的疫病，我國(guó)動(dòng)物防疫法將其列為I 類動(dòng)物疫病[4]。由于ASFV 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存活時(shí)間長(zhǎng)，基因組龐大且易變異，而且其大多數(shù)蛋白結(jié)構(gòu)與功能尚不清楚，以至于目前尚無(wú)有效的疫苗來(lái)預(yù)防ASFV[5,6]。當(dāng)下除了要加快有效疫苗的研發(fā)，更重要的是利用準(zhǔn)確、快速的診斷技術(shù)及時(shí)做出準(zhǔn)確的診斷，對(duì)于非洲豬瘟病毒的防控和凈化具有重要意義。本文對(duì)非洲豬瘟及非洲豬瘟病毒診斷技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為非洲豬瘟病毒準(zhǔn)確、快速診斷和疫病凈化提供參考。

一、非洲豬瘟

1.病原學(xué)

非洲豬瘟病毒（ASFV）在病毒學(xué)分類上屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬，是ASFV 家族的*成員[7]。ASFV 是二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA 病毒，大小在175～215nm，全基因組總長(zhǎng)為175～190kb[8,9]。根據(jù)目前的有關(guān)研究，ASFV 共有24 個(gè)基因型和1 個(gè)血清型，在我國(guó)流行的是基因Ⅱ型、血清8 群[10,11]。根據(jù)該病毒致病力的不同，可分為感染無(wú)臨床癥狀毒株、低致病性毒株、中等毒力毒株、強(qiáng)毒力毒株[12]。其主要通過(guò)呼吸道和消化道侵染機(jī)體，使其免疫系統(tǒng)受損，進(jìn)入血液后，引起組織器官出血[13]。

2.流行病學(xué)

豬是ASFV *的自然宿主，不同品種、不同日齡的豬均可感染。鈍緣蜱屬昆蟲是ASFV 的傳播媒介和貯藏寄主[14,15]，該病毒也是*以鈍緣蜱屬昆蟲為傳播方式的DNA 病毒[4]。該病毒主要通過(guò)直接或間接接觸帶毒豬的體液、排泄物以及血液等進(jìn)行傳播[16]。目前尚未發(fā)現(xiàn)其能對(duì)人類以及其他動(dòng)物具有感染性[17]。

3.臨床癥狀

豬一旦被ASFV 感染后，典型臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、食欲下降、皮膚發(fā)紺、嘔吐、便血和共濟(jì)失調(diào)等，剖檢后會(huì)發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)、腎、胃腸黏膜等出血，甚至還伴隨呼吸障礙等特征[2,18-20]。毒株毒力不同，引起的臨床癥狀也不同，可分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型。強(qiáng)毒力毒株感染豬后，通常表現(xiàn)為最急性型或急性型。最急性型一般無(wú)明顯癥狀，病豬突然死亡。急性型的病豬主要特點(diǎn)為高熱、中度厭食、呼吸困難、便血、皮膚發(fā)紺等，處于妊娠期的母豬均會(huì)流產(chǎn)。并且強(qiáng)毒力毒株造成的病死率*可達(dá)*。中等毒力毒株主要引發(fā)非洲豬瘟亞急性型，其臨床癥狀與急性型相似，但程度相對(duì)較低，病死率一般為30%～70%。低毒力毒株主要引發(fā)非洲豬瘟慢性型，臨床癥狀表現(xiàn)為呼吸困難、濕咳、消瘦、關(guān)節(jié)腫脹等，病死率一般為10%～20%[21-23]。

二、非洲豬瘟診斷技術(shù)

1.病原學(xué)檢測(cè)

①病毒分離

采集病豬血液或器官組織對(duì)非洲豬瘟病毒進(jìn)行分離，分離過(guò)程必須要在生物安全三級(jí)（包括三級(jí)）以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。在病毒分離過(guò)程中，將*和培養(yǎng)液加到血液或研磨組織中，離心獲取上清液，通過(guò)病變效應(yīng)、紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)等技術(shù)，確定豬是否感染非洲豬瘟[24,25]。

②紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)

紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（HAD）早在1960 年就已經(jīng)建立[24]。試驗(yàn)時(shí)，將豬血液或組織制作的懸液接種在原代白細(xì)胞培養(yǎng)物中，鏡檢時(shí)，若出現(xiàn)有紅細(xì)胞吸附在感染細(xì)胞表面，呈玫瑰花環(huán)或桑葚狀現(xiàn)象，即可判定為陽(yáng)性。該試驗(yàn)較煩瑣且耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境及實(shí)驗(yàn)操作人員的要求相對(duì)較高，具有一定的局限性[26,27]。

③ 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的原理是將抗體或抗原吸附在固相載體表面，檢測(cè)樣品中的抗原或抗體可與其特異性結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，將酶標(biāo)抗體再與該復(fù)合物結(jié)合，根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)即可判定結(jié)果[28]。隨著該技術(shù)不斷發(fā)展與應(yīng)用，其檢測(cè)結(jié)果也更加準(zhǔn)確而有效，具有方便、快速、設(shè)備儀器要求低、成本低等優(yōu)點(diǎn)。但是與紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)相比，其靈敏性和特異性較低，檢測(cè)結(jié)果受樣本影響較大；與PCR相比，其特異性和靈敏性低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性；樣本易受保存環(huán)境溫度影響，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性不能得到保證[24]。

④ 熒光抗體試驗(yàn)

熒光抗體試驗(yàn)（FAT）是對(duì)病豬冰凍切片或者組織切片進(jìn)行抗原檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，將病豬的冰凍切片、組織切片或已在載玻片上涂有已接種白細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀干燥后，浸入丙酮中進(jìn)行固定，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗非洲豬瘟病毒抗體，再用PBS 液沖洗后，在熒光顯微鏡觀察，如果胞漿中發(fā)現(xiàn)特異性熒光，判為陽(yáng)性。該實(shí)驗(yàn)具有很強(qiáng)的敏感性和特異性，可快速、簡(jiǎn)便地得到非洲豬瘟病毒檢測(cè)的結(jié)果。但實(shí)驗(yàn)對(duì)熒光素特異性要求較高，非特異性熒光素染色可能會(huì)造成假陽(yáng)性的結(jié)果，對(duì)急性非洲豬瘟的靈敏度高。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)對(duì)操作人員的要求較高，并且需要借助顯微鏡，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，常作為檢測(cè)非洲豬瘟病毒的輔助方法[11,25]。

⑤聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），具有敏感、快速、特異性高的特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)樣品的純度、血液樣品及組織的保存方式要求較低，被廣泛應(yīng)用于非洲豬瘟病毒的檢測(cè)。Agüero 等[29]根據(jù)p72 保守基因序列，設(shè)計(jì)引物，建立了快速檢測(cè)ASFV 的PCR 方法，且該方法得到OIE 認(rèn)證。但2015 年有相關(guān)研究認(rèn)為，該方法在檢測(cè)中會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果[30]。為解決這個(gè)問(wèn)題，Luo等根據(jù)p72 基因設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)不同地區(qū)4 個(gè)基因型的14 個(gè)代表毒株，表明該方法更為靈敏、準(zhǔn)確，能相對(duì)全面的檢測(cè)非洲豬瘟病毒[31]。

⑥ 多重PCR

此技術(shù)是在PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上建立并發(fā)展起來(lái)的，能在同一個(gè)反應(yīng)體系中，同時(shí)加入多對(duì)引物，分別擴(kuò)增到不同的靶標(biāo)，獲得相應(yīng)目的片段[32]。還能對(duì)DNA 和RNA 病毒進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，效率較高，降低了試劑耗材成本。如五重RT-PCR 鑒別診斷方法，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病的檢測(cè)[33]。

⑦ 納米PCR

該技術(shù)是將納米金屬顆粒添加到普通PCR 反應(yīng)中，使反應(yīng)體系熱導(dǎo)性更強(qiáng)，PCR 反應(yīng)更快，可提高反應(yīng)的特異性，消除非特異性擴(kuò)增，提高擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量，納米PCR 技術(shù)可使非洲豬瘟病毒檢測(cè)的靈敏度增加至1000 倍[34]。

⑧套式PCR

套式PCR 是先用外套引物進(jìn)行一次擴(kuò)增，再用內(nèi)套引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二次擴(kuò)增，提高擴(kuò)增的敏感性，該方法可從非洲軟蜱中檢測(cè)出非洲豬瘟病毒，可用于篩查不同種類蜱體內(nèi)的非洲豬瘟病毒[35]。

⑨實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，是在PCR 體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR 反應(yīng)過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[36]。該技術(shù)與常規(guī)PCR 相比較，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)化，可對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)的速度更快、靈敏度更高，并且特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高，有效解決常規(guī)PCR 污染等問(wèn)題[37]。

⑩等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，其始終維持在恒定溫度進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程無(wú)需精密的儀器，具備恒溫裝備即可，并且操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)時(shí)間短。不足的是缺乏熱循環(huán)中的變性、退火等程序，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，僅適用于疾病的初步篩查，在一定程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用。且檢測(cè)試劑盒中酶的成本較高，造成單個(gè)樣品檢測(cè)費(fèi)用比普通熒光PCR 高[38]。

2.血清學(xué)檢測(cè)

①酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是血清學(xué)檢測(cè)方法中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)技術(shù)，具有快速、靈敏、成本低、特異性高、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，適用于大規(guī)模樣品的排查、疫病監(jiān)測(cè)以及自動(dòng)化血清學(xué)檢測(cè)。一般情況下，國(guó)內(nèi)外常用p30/p32、p54、p72、p73 等作為檢測(cè)ASFV 抗體的蛋白，該方法可通過(guò)這些蛋白直接檢測(cè)出較低或中等毒力感染豬抗體[37]。王彩霞等[39]以ASFV p72 蛋白為包被抗原，建立阻斷ELISA 方法檢測(cè)豬血清中抗ASFV p72 蛋白的抗體，對(duì)ASFV 陽(yáng)性血清靈敏度*為1∶128，具有較高的特異性、敏感性和良好的重復(fù)性。

②膠體金試紙檢測(cè)技術(shù)

膠體金試紙檢測(cè)技術(shù)是將特異性抗原或抗體與膠體金結(jié)合，形成膠體金免疫復(fù)合物，膠體金聚集于檢測(cè)線顯色，通過(guò)觀察顯色反應(yīng)，即可判定結(jié)果。該技術(shù)可通過(guò)目測(cè)法判斷結(jié)果，不需要專業(yè)的儀器設(shè)備，具有操作簡(jiǎn)單，特異性、靈敏度高等特點(diǎn)，適合現(xiàn)場(chǎng)、基層、大規(guī)模排查或是生豬調(diào)運(yùn)臨場(chǎng)的使用[40]。張?chǎng)斡畹萚2,41]于2014 年以非洲豬瘟p54 的重組蛋白為核心蛋白標(biāo)記膠體金，再分別用葡萄球菌A 蛋白和抗p54 多抗作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，按一定順序制備非洲豬瘟p54 抗體膠體金試紙，建立了p54 抗體膠體金檢測(cè)法，該試紙與豬的其他病毒抗體陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，表明該檢測(cè)法的敏感性和特異性高。

③間接免疫熒光試驗(yàn)

間接免疫熒光試驗(yàn)是利用特異性抗體和樣品中相應(yīng)抗原反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，再用熒光標(biāo)記的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察熒光。該試驗(yàn)敏感度高，但對(duì)試驗(yàn)條件及操作要求較高，常用于復(fù)核ELISA 檢測(cè)中的可疑樣品[24,37,40]。

三、小結(jié)

非洲豬瘟是我國(guó)重點(diǎn)防范的外來(lái)疫病之一，在全球已流行一百多年。自2018 年我國(guó)首次發(fā)生非洲豬瘟以來(lái)，我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)以及人們的日常生活都受到了嚴(yán)重的影響。目前尚無(wú)疫苗和藥物可用于預(yù)防和治療非洲豬瘟，因此，快速、有效、科學(xué)的診斷技術(shù)對(duì)非洲豬瘟防控尤為重要。該文從非洲豬瘟病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床癥狀及診斷技術(shù)等方面進(jìn)行了綜述，以期各個(gè)地區(qū)能根據(jù)實(shí)際情況，綜合各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)科研單位也應(yīng)根據(jù)目前診斷技術(shù)的不足，加大力度研發(fā)更佳的診斷方法。